-  ساده

2-  تفريقي

در حالت تفريقي از دو رنگ مي توان استفاده نمود كه حالت كنتراست داشته باشند . اما در رنگ آميزي ساده از يك رنگ استفاده مي شود .

هدف ما از رنگ آميزي تشخيص گران مثبت يا گران منفي بودن باكتري است .

رنگ آميزي ساده را با متيلن بلو انجام داديم .

نتايج آزمايش كشت باكتري :

كشت در پليت به صورت كلوني تك ديده مي شود . در مايع كشت بسيار عالي و به رنگ نارنجي در آمده است . سطح مورب به صورت خوب كشت شده و رنگ آن زرد تيره ( رنگ روغن مايع ) شده است كه قبلا قرمز آجري بود . در SIM مسير فرو رفتن آنس به صورت ابر مانند مي باشد .

Plate : Raised & Circular & Smooth

تهيه اسمير ميكروبي و رنگ آميزي آن :

در واقع ما در اين تكنيك باكتريهايي را كه مي خواهيم در زير ميكروسكوپ با اهداف مختلفي بررسي كنيم ابتدا بايستي كه يك گسترش را از آنها تهيه كنيم به اين صورت كه بايد يك لايه نازكي از اين جمعيت باكتريايي تهيه كنيم بعدا اينها را تثبيت مي كنيم روي لام و پس از رنگ آميزي زير ميكروسكوپ بررسي مي كنيم . براي شروع كار از يك لام تميز استفاده مي كنيم . ابتدا از آب مقطر يك مقدار بر مي داريم خيلي كم روي لام مي گذاريم بعد نوك آنس را آغشته مي كنيم و در داخل لام كاملا پخش مي كنيم بعد در فضاي آزمايشگاه بايد خشك شده و براي تثبيت از روي شعله رد مي كنيم . تا مدتي كه دست را نسوزاند . مايع را نيز بعد از استريل كردن آنس در محيط مايع فرو مي بريم و بعد يك يا دو بار در محيط فرو مي بريم و بعد روي لام جديد مي ريزيم .

رنگ آميزي گرم :

در روش رنگ آميزي گرم ما از سه رنگ استفاده مي كنيم كه 2 تا از اين رنگها نقش مستقيم در اين رنگ آميزي دارند و براساس  اينكه باكتري ها چه رنگي را به خودشان خواهند گرفت مي توان آنها را بعدا دسته بندي كنيم به گرم + و گرم _ اي روش براي اولين بار در سال 1884 توسط كريستين گرند ابدا‌ء شد و به مرور زمان يك سري تغييراتي در آن به وجود آمد ولي به طور كلي اساس كار تفاوت چنداني نمي كرد .

اساس كار:

ما ابتدا از يك رنگي استفاده مي كنيم بنام رنگ اوليه Primary stain كه با اين رنگ آميزي هر دو گروه رنگ خواهند گرفت .

از يك تركيب رنگ بر استفاده مي كنيم ( De colorization agent ) .

رنگي كه باعث ايجاد كنتراست مي شود . (Coanterstain)

كه در مرحله آخر اجرامي كه به وسيله عامل رنگ بر رنگشان را از دست داده اند به اين رنگ آغشته مي شوند .

رنگ اوليه كريستال ويوله كه آبي است .

رنگ بر اتيل الكل 95% است .

رنگ آخر سافرانين يا فوشين است . (قرمز رنگ).

براي اينكه مراحل از يادمان نرود مي توانيم همواره دو كلمه كلاس و كلاف را به خاطر داشته باشيم .

اينكه چرا يكسري از باكتريها رنگ اوليه را به خود جذب مي كنند و آن را موقع استفاده از رنگ بر از دست نمي دهند و برعكس يك سري ديگر رنگشان را به راحتي از دست مي دهند بنا به يك سري اعتقادات بر مي گردد به تركيب شيميايي غشاء باكتريها . ولي شواهدي نيز وجود دارد كه تركيب غشاء نمي تواند چندان در اين امر دخيل باشد . به طور مثال مخمرها كه جزء باكتريها اصلا حساب نمي شوند و ساختار ديواره سلولي آنها نيز كاملا متفاوت از باكتريهاست . ولي در رنگ آميزي گرم به صورت گرم + ديده مي شوند لذا عقيده بر اين است كه بيشتر منافذي كه در غشاء وجود دارند و قابليت نفوذپذيري اين منافذ و يكسري پديده هاي فيزيكي در اين نحوه رنگ آميزي دخيل هستند .

1.     در سطح خارجي باكتريهاي گرم + قشري از نمك منيزيم ريبونوكلئيك وجود دارد كه با رنگ كريستال ويوله و لوگول تركيب پايدار ايجاد ميكند و در اثر مواد بي رنگ كننده نيز اين رنگها از باكتري ها خارج نمي شوند و اين در حالي است كه باكتريهاي گرم منفي فاقد اين ويژگي هستند .

2.     PH  ايزو الكتريكي براي باكتريهاي گرم + پايين تر از باكتريهاي گرم _ است روي اين اصل باكتريهاي گرم + در حدود 100 برابر بيشتر از گرم منفي ها كريستال ويوله و يد را جذب مي كنند و به راحتي هم اين رنگ را از دست مي دهند .

3.     گفته مي شود كه كريستال ويوله و يد در داخل باكتريها با هم تركيب شده و مولكول درشتي را به وجود مي آورند ه اين مولكول نمي تواند از جدار گرم + ها خارج شود در حالي كه در گرم _ به راحتي مي تواند رنگ از طريق ديواره خارج گردد .

4.     بخش اعظم Cell wall  گرم _ ها از ليپوپروتئين است و تحت تاثير ماه رنگ بر الكل و استون چربي هاي آن حل شده و كمپلكس رنگي خارج مي شود .

تذكر مهم :

اگر مدت زمان استفاده از رنگ بر طولاني شود باكتريهاي گرم+ به صورت گرم _ ديده خواهند شد . وهمچنين اگر براي تهيه لام از باكتريهاي پير و مرده استفاده شود كه اينها قدرت نگهداري رنگ را ندارد بنابراين به رنگ گرم _ در مي آيند .

روش كار:

ابتدا يك اسمير ميكروبي تهيه مي كنيم ، آن را خشك و بعد Fix مي كنيم و بعد آماده مي شود براي رنگ كردن . سطح اسمير را با كريستال ويوله مي پوشانيم يك دقيقه صبر مي كنيم . با يك پيست حاوي آب مقطر اضافي رنگ را مي شوييم بعد روي آن لوگول مي ريزيم و يك دقيقه صبر مي كنيم . بعد از اين كار اضافي اين را با آب شستشو مي دهيم . بعد از اين مرحله از رنگ بر استفاده مي كنيم . بايد دقت شود استفاده از اتيل الكل بيش از حد طولاني نشود . نهايتا روي آن سافرانين يا فوشين مي ريزيم و 45  ثانيه صبر مي كنيم و اضافي آنرا مي شوييم و خشك مي كنيم و با ميكروسكوب 100 و روغن ايمرسون بررسي مي كنيم .

گرم +                 به رنگ آبي تا بنفش ( كه مال كريستال ويوله است )

گرم _                به رنگ قرمز ( كه مال سافرانين يا فوشين مي باشد )

كلاس : ك, كريستال ويوله . ل , لوگول . ا, اتيل الكل . س , سافرانين .

كلاف : ‌ ك, كريستال ويوله . ل , لوگول . ا, اتيل الكل . ف , فوشين .

موارد مورد مشاهده شده :

سرئوس :

باسيل بوده و گرم + مي باشد .

اورئوس :

كوكسي بوده و گرم + مي باشد .

ليسترا مونو سايتراژنز:

به شكل باسيل هاي بسيار كوچك بوده و گرم + مي باشد .

ايكولاي :

به شكل باسيل كوتاه بوده و گرم _ است .

نكته : ما در رنگ آميزي مرحله آخر از فوشين استفاده كرديم .

پس : اورئوس فقط كوكسي       اي كولاي فقط گرم _

رنگ آميزي اسپور :

يك سري از باكتريها مي توانند ايجاد آندسپور كنند كه اين آندسپور در مقابل شرايط محيطي مي تواند در مقابل خشكي مقاومت زيادي داشته باشد . از آنجايي كه ساختار پوششي اسپور به نحوي است كه رنگ در شرايط عادي نمي تواند وارد آن شود بنابراين از يك روش خاصي براي اين رنگ آميزي استفاده مي كنيم . به دين صورت كه ما ابتدا از رنگ ( مالاشيت گرين ) سبز مالاشيت و جهت تسهيل ورود اين رنگ به داخل اسپور آن را حرارت مي دهيم . حرارت دادن نبايد به نحوي باشد كه موجب تبخير و يا جوشيدن رنگمان شود . براي حرارت دادن مي توانيم از هات پليت استفاده كنيم ولي بايد دقت كنيم كه حرارت تا حد جوش نرسد . 2 الي 3 دقيقه به آن حرارت مي دهيم , بعد خنك مي كنيم زير آب شستشو مي دهيم و سپس ب روي آن سافرانين اضافه مي كنيم به مدت حدودا 30 تا 40 بعد رنگ اضافه را شستشو مي دهيم و بعد خشك مي كنيم  و با ميكروسكوپ 100 بررسي مي كنيم . در اين روش رنگ آميزي اسپورها به رنگ سبز و فرم هاي ديگر سلول باكتري به رنگ قرمز خواهند شد .

در همان روز محيط SS Agar تهيه كرديم به دين صورت كه در داخل200 گرم آب مقطر 12 گرم آگار اضافه كرده و به مدت 15 دقيقه در اتوكلاو مي گذاريم .

رنگ آميزي كپسول : ( رنگ آميزي منفي )

براي رنگ آميزي كپسول از Nigrosin استفاده مي كنيم . طريقه درست كردن نيگروزين بدين صورت است كه 5/0 گرم از ماده خشك نيگروزين را در 100 سي سي آب مقطر حل مي كنيم .

روش كار:

يك لام تميز انتخاب مي كنيم در قسمت انتهايي قطره كوچكي از نيگروزين را مي گذاريم با استفاده از لوپ ( آنس حلقه ) يك مقدار از كلوني را برداشته و در داخل رنگ حل مي كنيم . با لام ديگر پخش مي كنيم و بعد خشك مي شود .

محيط هاي كشت SIM و TSI را تهيه مي كنيم . ( SIM  حالت ژلوز دارد TSI حالت جامد دارد .) به دين صورت كه براي SIM 6 گرم در 200 سي سي آب مقطر كه قهوه اي رنگ مي شود . و براي TSI 65 گرم در يك ليتر حل مي كنيم كه قرمز رنگ است . سپس آنها را در داخل لوله آزمايش انتقال مي دهيم بعد روي آنها پنبه غير هيدروفيل مي گذاريم سپس لوله ها را در داخل يك بشر مي گذاريم ( يا ظرف ديگر ) اتوكلاو مي كنيم (121 درجه 15 بار 15 دقيقه ) .

در مورد SIM  به حالت قائم مي گذاريم تا سفت شود . ولي در مورد TSI جا لوله را كج ( مورب ) مي گذاريم .

منبع:

گیاهپزشکی ۱۱۰